Relatório 1 - Dosagem de Glicose

Relatório 1 - Dosagem de Glicose

IFRJ – Campus Maracanã

Coordenadoria de Biotecnologia

Disciplina: Técnicas de Análises Biológicas

Turma: BM171

Professores: Julliene Ramos e Carlos Henrique

Relatório de Técnicas de Análises Biológicas

Dosagem de Glicose & Hemoglobina Glicada

Avaliação:

Critério:

Nota:

Apresentação

Introdução

Objetivos

Material Utilizado/ Métodos

Resultados

Discussão

Conclusão

Referências Bibliográficas

Total:

Alunos: Alexandre Garcez

Guilherme Cerqueda

Pedro Lobo

Rio de Janeiro, 19 de março de 2011.

Sumário

Introdução

Pág.: 3; 4

Objetivos

Pág.: 4

Material Utilizado e Métodos

Pág.: 5; 6; 7

Resultados

Discussões

Pág.: 7; 8; 9; 10

Conclusão

Pág.: 10

Referências Bibliográficas

Pág.: 11

  1. Introdução

Em um laboratório clínico, um dos exames mais importantes é o exame de sangue, isto se deve porque o sistema circulatório é o principal meio de transporte de nutrientes do organismo humano, chegando em todos os tecidos, em quantidades diferentes. O sistema circulatório serve para a nutrição dos tecidos, bem como a excreção de produtos metabólicos e outras substâncias indesejáveis. O sistema circulatório também é o meio pelo qual muitas células da imunidade se transportam para diversos tecidos, e no qual anticorpos também podem ser encontrados.

Com todas essas características é possível saber através de exames de sangue se certos nutrientes estão em concentrações desejáveis no sangue, se produtos tóxicos estão sendo excretados com eficiência, é possível monitorar o desempenho de certos órgãos, ou descobrir se tecidos estão sendo degradados, assim como verificar a existência de antígenos não próprios, assim como verificar as características das próprias células do sangue.

A glicose é uma molécula muito comum no nosso sistema circulatório, pois é ela responsável por boa parte da nutrição dos nossos tecidos, estando bastante envolvida em ciclos para a geração de energia. Há tecidos, como o cérebro, que apenas podem se nutrir de açucares, como a glicose, o que a torna ainda mais importante. O meio pelo o qual a glicose entra nas células é através de canais, que apenas se abrem se houver insulina se ligando a receptores específicos na membrana das células. Em um individuo saudável esse processo é comum, e o equilíbrio entre a concentração de glicose circulante no sangue, e no interior das células se mantém estável, porém há doenças e certos distúrbios que podem desestabilizar isto.

As diabetes mellitus são um grande exemplo de doenças que podem tornar instável este equilíbrio. Na diabete, especificadamente, o nível de glicose no sangue aumenta, pois ela não consegue entrar na célula, por conta de uma ausência na produção de insulina (tipo I) ou uma produção ineficiente (tipo II), por diversos motivos. Tanto níveis elevados quanto baixos de glicose no sangue podem causar, ou ser indicativo de várias doenças/distúrbios, além das diabetes, como: hipo/hiperatividade da tireóide, piruitária ou adrenal, “overdose” de insulina, tumores secretores de insulina, etc.

Uma dosagem das concentrações de glicose no sangue podem auxiliar para um diagnóstico mais confiável. É dito que pode-se diagnosticar uma diabetes a partir de 3 testes de glicemia que tenham valores acima de 126 mg/dL de glicose no sangue em jejum, embora não seja possível dizer, apenas com isso, a qual tipo o paciente pertence.

Entre os métodos de dosagem de glicose temos o método enzimático que se baseia em uma reação de oxidação com a glicose, e em seguida um de seus substratos com um reagente cromógeno, ou seja, que gera cor, fazendo com que desta forma possa ser medida, através dos valores de absorbância no espectrofotômetro, a concentração de glicose que havia no tubo.

Outro exame que envolve a glicose é a hemoglobina glicada, que é um fenômeno mais marcante em pacientes diabéticos. O fenômeno consiste na adição de glicose ao N-terminal da cadeia beta da hemoglobina, que ocorre por conta das altas concentrações de glicose existentes no sangue de um diabético. Através da quantificação das hemoglobinas totais no sangue e as hemoglobinas glicadas é possível achar uma faixa de porcentagem normal em um organismo humano, e verificar se os níveis estão alterados. Isso se dá através de um reagente que retém as hemoglobinas não glicadas, sendo possível separá-las das glicadas para então ser lida sua absorbância e calcular a concentração. Testar as hemoglobinas glicadas é muito importante, pois é um teste que independe do tempo de jejum do diabético já que a hemoglobina tem vida útil de aproximadamente 120 dias, tendo menor chance de erros na avaliação.

É importante ressaltar que qualquer exame de sangue e seus resultados dependem dos erros pré-analíticos, analíticos e pós-analíticos que possam ocorrer desde antes da coleta do sangue, o processo de coleta, até o momento de avaliação dos resultados.

  1. Objetivos

  • A realização do método enzimático para a dosagem de glicose no sangue, de forma a compreender e se familiarizar com esse ensaio comum em laboratórios clínicos, sem o intuito de diagnostico, por conta da ausência de cuidados pré-analíticos como o jejum.

  • Determinação quantitativa de hemoglobinas glicadas, ou seja, o nível de exposição de hemoglobinas à glicose circulante, sendo este um importante ensaio diagnóstico para doenças como diabetes mellitus.

  1. Material Utilizado e Métodos

  • Material Utilizado:

Material para coleta:

▪ Agulha estéril e descartável

▪ Adaptador de coleta a vácuo

▪ Garrote

▪ Algodão▪ Álcool 70%

▪ Tubo com vácuo sem anticoagulante (tampa vermelha)

▪ Tubo com vácuo com EDTA (tampa lavanda)

Material para ambos os ensaios:

▪ Luvas descartáveis

▪ Óculos de proteção

▪ 9 Tubos de ensaio

▪ 7 Cubetas

▪ Pipetas automáticas de 20, 200 e 1000 µ L

▪ Espectrofotômetro

Material para dosagem de glicose:

▪ 3,0mL de reativo de trabalho

▪ 10 µ L de soro padrão

▪ 10 µ L de soro da amostra

Material para hemoglobina glicada:

▪ 1,0 mL de reagente lisante

▪ 100 µL de sangue padrão 10% +/- 0,2% (m/m)

▪ 100 µL de sangue da amostra

▪ 10mL de resina de troca iônica, tamponada, com filtro separador

  • Métodos:

Coletagem do sangue:

A coletagem, por punção venosa, foi realizada pelos professores seguindo o método adequado especificado a seguir: o garrote foi colocado no braço de um componente de cada grupo, acima da dobra do cotovelo, por meio de um falso laço, para que haja facilidade na posterior retirada deste, verificando-se o pulso para que este não tenha sido interrompido, e simultaneamente para escolher a melhor veia para a punção. Em seguida, foi realizada a assepsia com álcool 70% e um algodão, sobre o local a ser puncionado, no sentido do garrote, prendendo parcialmente o algodão sobre o falso laço para ser utilizado após a coletagem. A agulha estéril e descartável foi retirada da embalagem, especificando essas características para o doador, e esta agulha foi acoplada no adaptador. Então introduziu-se na pele ao lado da veia e lentamente penetrou-a. Acoplando-se o tubo a vácuo o sangue fluiu naturalmente para seu interior. No tubo com anticoagulante foi necessária uma pequena agitação para que ele se misturasse com a amostra. Retirou-se o garrote, colocou-se o algodão no local em que logo em seguida foi retirada a agulha, aplicando-se uma certa pressão para evitar sangramentos.

Dosagem de glicose sérica:

Três tubos foram preparados, sendo um branco, um padrão, e um da amostra de sangue previamente coletada, segundo o quadro abaixo:

Branco

Padrão

Amostra

Reativo de trabalho

1.000µL

1.000µL

1.000µL

Amostra padrão de soro

-

10µL

-

Amostra de soro do sangue coletado

-

-

10µL

Por 10 minutos esses tubos foram incubados a 37°C, já que essa temperatura ajuda para que as enzimas ajam com eficácia. Logo após este tempo, transferiu-se o conteúdo destes tubos para três cubetas ao qual foram levadas para leitura no espectrofotômetro à 505nm, sendo o tubo em branco o utilizado para zerar o aparelho.

Hemoglobina glicada:

Um tubo padrão recebeu 500 µL de reagente lisante e 100µL de sangue padrão, enquanto que o tubo de amostra recebeu 500µL de reagente lisante e 100µL do sangue coletado. Após deixar os tubos descansando por 5 minutos, transferiu-se 100µL de cada um para dois tubos contendo 5mL de resina.

Os tubos foram agitados por volta de 5 minutos para então inserir-se em ambos filtros separadores em forma de coluna, de diâmetro semelhante aos tubos, para desta forma exercer uma pressão maior sobre as amostras. Os líquidos que subiram para o recipiente da coluna foram transferidos para cubetas e lidos no espectrofotômetro em 415nm.

Para poder encontrar uma relação da hemoglobina glicada com a normal realizou-se mais um ensaio, com dois tubos, padrão e de amostra, contendo respectivamente 5mL de água mais 0,02mL de sangue padrão hemolisado, e 5mL de água com 0,02mL de sangue coletado hemolisado. Essas soluções também foram transferidas para cubetas e lidas no mesmo espectro de onda.

  1. Resultados

Após medir a absorbância das amostras no espectrofotômetro o grupo apresentou os seguintes resultados:

Amostra

Absorbância

Hemoglobina Glicada Padrão

1,216

Hemoglobina Glicada Amostra

0,724

Hemoglobina Total Padrão

0,328

Hemoglobina Total Amostra

0,832

Sabendo as absorbâncias e que a concentração do padrão é de 10% +/- 0,2% (m/m), podemos fazer os seguintes cálculos para a descoberta da porcentagem de hemoglobina glicada na amostra:

Proporção do padrão ==> absorbância da hemoglobina glicada padrão/absorbância da hemoglobina total padrão

1,216/0,328 = 3,707

Proporção da amostra ==> absorbância da hemoglobina glicada amostra/absorbância da hemoglobina total amostra

0,724/0,832 = 0,870

A porcentagem de hemoglobina glicada na amostra pode então ser calculada com a seguinte equação: ( proporção da amostra/proporção do padrão ) x concentração do padrão

( 0,870/3,707 ) x 10,2 = 2,394                      ( 0,870/3,707 ) x 9,8 = 2,299

Constata-se então que a porcentagem de hemoglobina glicada na amostra encontra-se na faixa de 2,299 %  - 2,394%.

Quanto ao teste de concentração de glicose sérica, foram observados os seguintes resultados de absorbância:

Glicose Sérica Padrão

0,298

Glicose Sérica Amostra

0,257

Podemos então calcular a concentração de glicose sérica na amostra a partir dos seguintes cálculos: 

( 100/absorbância da glicose sérica padrão ) x absorbância da glicose sérica amostra

( 100/0,298 ) x 0,257 = 86,2

Observa-se que a concentração de glicose sérica na amostra é de 86,2 mg/dL

  1. Discussão

Para a dosagem de hemoglobina a coleta de sangue é feita em um tubo contendo anticoagulante, isso impede as hemácias de formarem coágulos, já que irá bloquear determinados fatores de coagulação (geralmente cálcio), o sangue coletado no tubo contendo anticoagulante recebe a adição de reagente lisante, o qual promove a lise das hemácias, permitindo que a hemoglobina presente no interior destas, se apresente livre no meio, tornando assim a dosagem de hemoglobina possível, o que não seria possível caso não fosse utilizado anticoagulante, devido a formação de coágulos.

A hemoglobina não glicada tem uma facilidade de se ligar a resina, desta forma, quando foi aplicada uma pressão na coluna, ao líquido que subiu possui-a apenas hemoglobinas glicadas, enquanto o que se manteve sem se difundir pelo filtro separador tem as hemoglobinas não glicadas ligadas a resina.

O reativo de trabalho é utilizado na dosagem de glicose sérica, ocasionando a oxidação da glicose presente no sangue, esta reação possui como um dos resultados a formação de peróxido de hidrogênio, este peróxido de hidrogênio a partir de uma reação catalisada pela peroxidase, também presente no reativo de trabalho, ocasionará numa mudança da cor do soro, o qual passa a ser uma solução avermelhada, este avermelhado é diretamente proporcional a concentração de glicose na amostra, ou seja, quanto maior a concentração de glicose na amostra mais vermelha esta irá se apresentar após a adição do reativo de trabalho.

Observando o resultado da absorbância vê-se que a absorbância da Hemoglobina Glicada Padrão está acima de 1, o que interpreta-se como um resultado errôneo, onde o procedimento correto seria diluir as amostras até que todos os resultados de absorbância ficassem abaixo de 1. O resultado acima de 1 poderia ser considerado erro de procedimento do grupo, porém neste caso é pouco provável, já que resultados de absorbâncias acima de 1 foram observados em demasiados grupos:

Grupo 1 - Caio, Bia e Mayra

Hb glicada: 1,180

Grupo 4 - Athur, Bruno e Pedro H.

Hb glicada: 1,203

Grupo 5 - Larissa, Paulo e Sabrina

Hb glicada: 1,561

O mais provável nesse caso é que os resultados foram estes devido aos reagentes fora de validade.

No cálculo da hemoglobina glicada os resultados estão muito abaixo do normal, sendo a faixa de 6% - 8,3%. Porém, como dito acima, esses resultados não podem ser levados em conta, uma vez que os reagentes usados muito provavelmente não agiram como o esperado, fato comprovado pelas absorbâncias altas e diferenças de absorbâncias entre padrões que deveriam ser iguais.

No cálculo da método enzimático tivemos um valor normal, uma vez que a faixa de normalidade varia de 70 à 110 mg/dL, o que demonstra a realização correta do método.

  1. Conclusão

Foi possível a realização de técnicas bastante comuns em laboratórios clínicos, e visualizar a simplicidade dessas, podendo-se compreender cada procedimento realizado, e discutir sobre potenciais fatores de erro, já que em um dos ensaios os resultados se distanciaram bastante da realidade. É possível a minimização de erros com uma limpeza adequada da vidraria, uma vez que pode conter substâncias que seriam inibidores enzimáticos, além de eliminar impurezas que poderiam estar absorvendo espectros de luz durante a leitura, dando valores incorretos de absorbância. Tendo-se conhecimento disto pode-se afirmar que a prática serviu no intuito de ensinar a respeito das manipulações de amostras em laboratórios clínicos, de maneira à auxiliar em futuros ensaios.

  1. Referências Bibliográficas

Literatura:

  1. LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M.M. Lehninger Princípios de Bioquímica – 4.ed.- São Paulo : Ed. Sarvier, 2007.

  2. Bula de método de dosagem de glicose / método enzimático LABORLAB.

  3. Bula de dosagem de glicohemoglobina INLAB.

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