Baixe Apostila de Cromatografia- parte 2 e outras Notas de estudo em PDF para Engenharia Química, somente na Docsity! Alexandre Schuler CROMATOGRAFIA A GÁS E A LÍÍ QUII DO (detetores, aquisição de dados, validação e avaliação estatística) Volume 2 O itava Edição 2004 Alexandre Schuler Professor Adjunto 4 Departamento de Engenharia Química Universidade Federal de Pernambuco CROMATOGRAFIA A GÁS E A LÍÍ QUII DO (detetores, aquisição de dados, validação e avaliação estatística) Volume 2 O itava Edição 2004 Alexandre Schuler - Cromatografia 3 4.3. Detetores 4.3.1. Generalidades Os detetores mais empregados são do tipo diferencial. A sua resposta (R), dada pelas áreas relativas dos picos, é proporcional à concentração de cada componente (detetores de condutividade térmica) ou à velocidade de fluxo de massa do componente (detetores de ionização): R = K .C R = K . dm dt 1 2 Dentre os detetores dos tipos descritos acima, destacam-se, pelo maior uso, os seguintes: detetor de condutividade térmica (DCT), detetor de ionização de chama (DIC) e detetor de índice de refração (DIR), embora existam outros, de mais restrita aplicação. A escolha do detetor é importante e depende do material a ser analisado. As principais características dos detetores, que devem ser consideradas quando da seleção do detetor mais apropriado, são as seguintes (ver Apêndice 1, p 56): - Sensibilidade - Nível de ruído - Resposta (Sinal) - Faixa de linearidade dinâmica - Custo/vida útil - Universalidade - Especificidade / Seletividade - Limite de Detecção (relação sinal/ruído). 4.3.2. Detetores empregados em Cromatografia a Gás a) Detetor de Condutividade Térmica (DCT) O sistema de detecção por diferença de condutividade térmica consiste de dois pares filamentos (células para amostra e células de referência), os quais fazem parte de uma ponte de Wheatstone (Figuras 4.4a e 4.4b). O filamento pode ser de platina, níquel, tungstênio ou ligas de tungstênio, como W/Re, normalmente coberto de ouro, para aumentar a resistência à corrosão. Faz-se passar corrente pelos filamentos e estes perdem calor para o gás de arraste. No momento em que a amostra atingir a célula correspondente, o filamento perderá calor para a solução (gás de arraste + amostra). Como a solução possui condutividade térmica diferente da fase móvel pura, a temperatura do filamento é alterada, o mesmo ocorrendo com a sua resistência elétrica. Essa variação na resistência é medida pela ponte. Note-se que quanto maior for a concentração do material analisado, maior será a variação na corrente e portanto maior será o sinal (R = K.C). A sensibilidade de um detetor de condutividade térmica pode ser avaliada pela equação: Alexandre Schuler - Cromatografia 4 S = KI . ( ) . (T - T )2 g - s g f b λ λ λ (eq. 8) onde: S = sensibilidade (mV.cm3/mg) K = constante da célula I = intensidade de corrente (mA) R = resistência do filamento (Ω) λg= condutividade térmica do gás de arraste (cal/cm.s) λs = condutividade térmica da substância (cal/cm.s) Tf = temperatura do filamento ( oC) Tb = temperatura do bloco ( oC) IMPORTANTE ! Se as células do detetor contiverem ar atmosférico no momento em que o circuito for energizado ocorrerá queima do filamento. Portanto, deve-se primeiro fazer circular o gás de arraste. Figura 4.4.a - Bloco do Detetor de Condutividade Térmica. b) Detetor de Ionização de Chama (DIC) A figura 4.5 representa o circuito eletrônico de um DIC. Rv é uma resistência variável, cujo valor depende do número de partículas entre os eletrodos. O efluente da coluna, ao passar entre os eletrodos, é ionizado. Nos DIC, a fonte de ionização é a chama resultante da combustão de hidrogênio com ar (gases auxiliares). A corrente contínua gerada pela fonte (fonte CC, Fig 4.5.b) é transportada do polarizador para o coletor (Fig 4.5.a) por impurezas existentes na fase móvel ou por partículas de fase estacionária líquida arrastada pela fase móvel, por exemplo. No amplificador existe outra fonte de corrente, sendo esta variável e de sentido contrário, permitindo assim zerar a corrente resultante no circuito. Quando um componente da amostra atinge o detetor, caso possua átomos de carbono e átomos de hidrogênio, entrará em Alexandre Schuler - Cromatografia 5 combustão, sendo ionizado. Com a ionização, aumenta a corrente de saída do coletor, o que irá gerar uma tensão (∆V), a qual é ampliada pelo amplificador eletrométrico e enviada ao registrador/integrador. Evidentemente, a sensibilidade do detetor dependerá da facilidade relativa de ionização de cada componente da amostra. Figura 4.4b- Diagrama Eletrônico do DCT Fig. 4.5.a- Estrutura física de um DIC c) Detetor de Captura Eletrônica (DCE) Embora possuindo circuito semelhante ao de um DIC, o DCE, ao contrário daquele, mede a queda de corrente quando da passagem de amostra pelos eletrodos (Rv). Uma fonte de 3H-1 ou de 63Ni ioniza as moléculas do gás de arraste (N2), liberando os elétrons responsáveis pela corrente (corrente de fundo). Se uma substância capaz de absorver esses Alexandre Schuler - Cromatografia 8 onde λ é o caminho ótico (distância percorrida pela luz dentro da solução; espessura da célula). A constante de proporcionalidade ε denomina-se absortividade molar. A absorbância, por sua vez, é proporcional à transmitância, fração de luz transmitida. Quando o conteúdo da célula (Fig. 4.8) é transparente à radiação empregada (UV ou VIS), a transmitância é 100 % e evidentemente a absorbância é ZERO. Entretanto, quando chega à célula uma substância que absorva essa luz, o sistema de detecção mede a diferença em intensidade, gerando o cromatograma correspondente. Os instrumentos mais comuns (e mais baratos) utilizam como fonte de radiação uma lâmpada de mercúrio, cuja radiação é monocromática (discreta), com comprimento de onda de 254 nm. Esses instrumentos, portanto, operam com um comprimento de onda fixo (e único). A Fig. 4.8 representa um diagrama esquemático desse tipo de instrumento. Como a região útil da radiação UV varia de 190 a 370 nm, é de se esperar que mesmos os compostos que absorvem luz UV não venham a ser detectados em um detetor do tipo fixo, ou que sejam detectados com baixa sensibilidade. Para se conseguir uma varredura em toda a região UV, é primordial, evidentemente, que a fonte de radiação possa emitir luz com todos os comprimentos de onda da faixa de interesse (fonte não monocromática, ou contínua). Para tanto, emprega-se a lâmpada de deutério. Nesse caso, o instrumento (UV variável) necessita de um dispositivo que selecione um determinado comprimento de onda, de modo a irradiar a amostra com uma luz monocromática. Esse dispositivo chama-se “monocromador”. A seleção do comprimento de onda pode ser manual (UV ajustável). Nesse caso, comporta-se como um UV fixo, embora possa ser selecionado qualquer comprimento de onda dentro da região UV. Existe um outro tipo de equipamento (UV de varredura), no qual a alteração do comprimento de onda é automática, indo de um ao outro extremo da região UV, num intervalo de tempo muito menor que o tempo de residência da amostra na célula analítica. Com esse equipamento, substâncias que absorvam em comprimentos de onda bem diferentes podem ser detectadas em uma única corrida. Também existem equipamentos que operam na região visível (400-750 nm), que empregam uma lâmpada de tungstênio, cuja radiação também é contínua. Finalmente, existem equipamentos que operam em ambas as faixas (UV-VIS). Alexandre Schuler - Cromatografia 9 Figura 4.7 - Detetor de Índice de Refração tipo Fresnel. Figura 4.8 - Detetor de Ultravioleta fixo Alexandre Schuler - Cromatografia 10 6 - ANÁLISE QUALITATIVA O tempo de retenção (Tr) é uma característica físico-química e como tal permite que se faça análise qualitativa, desde que se disponha de um padrão. Na falta do padrão, é necessário coletar cada componente isoladamente e identificá-lo por outros métodos analíticos; espectrometria, por exemplo. Atualmente, são comercializados cromatógrafos (a gás e a líquido) cujo detetor é um espectrômetro de massas. Quando uma amostra é submetida à análise, é preciso fornecer ao analista alguns dados a respeito da mesma: - Origem (de síntese, natural, etc ?); - Componentes prováveis (espécie, número); - Composição quantitativa provável; - Solubilidade; - Faixa de ponto de ebulição (amostra líquida); - Outros dados relacionados com as variáveis do processo. Quanto maior for o número de informações, mais rapidamente o analista encontrará as condições ideais de análise. Como existe apenas uma vazão ideal para cada coluna, resta ao analista procurar a coluna e a temperatura (ou programação de temperatura) ideais. Existem outros modos de efetuar a identificação, os quais serão estudados mais adiante (Capítulo 8). Alexandre Schuler - Cromatografia 13 Fig. 6.1 - Método gráfico para determinação de áreas relativas em cromatografia. OBS.: Essa técnica pode ser empregada também nos casos em que A fica abaixo de L’ e é denominada CORREÇÃO VERTICAL. Se o primeiro pico for muito menor que o segundo (Fig. 6.3), o procedimento é exatamente igual. Por outro lado, na situação inversa, a medição da área do segundo pico é feita como mostrado na Fig. 6.4. Essa segunda técnica chama-se CORREÇÃO TANGENCIAL. Se houver um outro pico sobre a cauda do primeiro e o ponto A estiver acima da tangente, procede-se a uma correção vertical entre os dois pequenos. Figura 6.2 - Correção vertical Figura 6.3 - Correção vertical Fig. 6.4 - Correção horizontal 6.3. Métodos de Cálculo Os métodos de cálculo descritos a seguir já incluem a correção da área. a) Normalização de área A seguinte relação é válida para um cromatograma dessa mistura: C A A . 100i = i iΣ (eq. 9) onde Ai é a área do pico de um componente qualquer e ΣAi a soma de todas as áreas. Evidentemente, é necessário que todos os componentes sejam detectados. Melhor seria que suas áreas fossem de mesma ordem de grandeza, pois em caso contrário, pode haver erro de exatidão maior que o aceitável. Além disso, é essencial que o detetor seja igualmente sensível a todos os componentes da amostra, senão haverá fatalmente um erro Alexandre Schuler - Cromatografia 14 de exatidão proporcional à diferença de sensibilidade. Exemplificando: numa amostra com dois componentes (50% de cada), se o detetor apresentar para o componente A o dobro da sensibilidade apresentada em relação ao componente B, o resultado, aplicando a eq. 9, seria: 33,3% de B e 66,7% de A. Das três restrições apresentadas acima, a mais difícil de ser atendida é a terceira. Assim, a equação 9 deve ser empregada com bastante cautela, ou apenas como uma primeira aproximação à solução do problema. Em seu lugar, pode ser empregada a eq. 10, onde Fi é um número que gera áreas (ditas corrigidas) que seriam obtidas caso o detetor fosse igualmente sensível a todos os componentes da amostra. C = A A . 100i c c i iΣ (eq. 10) onde Aci é a área corrigida de um componente qualquer e é calculada com auxílio da eq. 11: Aci = Ai.Fi (eq. 11) e Fi é calculado experimentalmente a partir do cromatograma de uma mistura sintética (solução padrão) contendo todos os componentes da amostra real: Fi = Ci/Ai (eq. 12) onde Ci é a concentração de um componente qualquer e Ai sua respectiva área. Quando todos os componentes de uma mistura pertencem a uma mesma função química, os fatores de correção (também denominados fatores de conversão - pois convertem a área em concentração ou massa - ou fatores de resposta) são praticamente iguais. Assim, admitindo-se que F1 = F2 = ... = Fn = F, pode-se fazer F = 1 e a equação 10 simplifica-se, transformando-se na eq. 9. O caso geral (eq. 10) é conhecido como Normalização de Área com Fator de Resposta (Norm %) e o caso particular (eq. 9) como Normalização de Área sem Fator de Resposta, ou simplesmente Área %. b) Padronização Interna Para a determinação da composição de uma amostra pelo método da Normalização de Área, é necessário que todos os seus vários componentes sejam detectados (a eq. 10 exige que sejam calculadas todas as áreas: ΣAci). Entretanto, não é fácil ter certeza absoluta de que todos os componentes foram realmente detectados. Além disso, se apenas um Alexandre Schuler - Cromatografia 15 único componente interessa ao analista, a sua determinação a partir de uma amostra com muitos componentes traria dois outros agravantes: i) Todo trabalho de medição e cálculo dos picos de interesse. ii) A probabilidade maior de um outro componente ter o mesmo tempo de retenção do componente de interesse. Para resolver o problema (ii) o analista poderia usar um detetor que se possível só detectasse o componente de interesse. Mas, como resolver o problema inicial ? A resposta a essas questões está na adição à amostra de uma substância nova, com as seguintes características: - Solúvel na amostra. - Detectável. - Possuir Tr diferente de qualquer componente detectável. - Não reagir com a amostra. Essa substância é denominada padrão interno. Seja uma solução padrão contendo todas as substâncias de interesse e o padrão interno (Pi), cujas concentrações e áreas sejam respectivamente: Ai e Ci - um componente qualquer de interesse. APi e CPi - o padrão interno. O procedimento experimental pode ser descrito do seguinte modo: a) prepara-se uma solução padrão (como no método Norm%), mas contendo apenas os componentes de interesse (sol. A); b) em seguida, prepara-se uma outra solução, onde o soluto será o padrão interno (ou uma solução de concentração conhecida) e o solvente será a sol. A (sol. B); c) com cada amostra, segue-se o procedimento do item anterior, substituindo-se a sol. A pela amostra (sol. C). d) finalmente, injeta-se igual volume das soluções B e C. Observe-se que a concentração do padrão interno é a mesma, nas soluções B e C. Assim, nos dois cromatogramas deve ser encontrada a mesma área, para o padrão interno, posto que a massa injetada foi a mesma (ver p. 57 – Linearidade). Caso essas áreas sejam diferentes, conclui-se de imediato que os volumes injetados não foram exatamente iguais. Como o operador deve estar operando na região linear (senão estaria cometendo um erro grosseiro), é válida a relação: Alexandre Schuler - Cromatografia 18 Para se decidir sobre o melhor método de cálculo para uma dada amostra, basta responder às questões apresentadas no Esquema 6.1. Esquema 6.1 - Critérios para seleção do melhor método de cálculo. Alexandre Schuler - Cromatografia 19 7 - OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO ANALÍTICO 7.1. Parâmetros analíticos Conforme foi visto ao longo dos capítulos anteriores, muitos fatores influem no processo cromatográfico. Essa influência não é aleatória, podendo portanto ser controlada pelo operador, com o objetivo de otimizar o processo de separação. A Tabela 7.1 mostra a importância do correto dimensionamento de uma coluna cromatográfica, enquanto que a Tabela 7.2 mostra a influência do volume injetado sobre L (largura do pico na base; ver Fig. 2.16, p. 15), n e H (ver Fig. 2.15, p. 14). O Gráfico 7.1 mostra a relação entre C e nmax (λ ) e entre C e Hmin(ο ), onde C é a concentração da fase estacionária. O Gráfico 7.2 mostra como esses parâmetros (n e H) variam com o comprimento da coluna (λ). A temperatura (T) modifica o tempo de retenção (tr). A variação do tr com T não é linear. A relação ∆tr / ∆T depende do composto em estudo e da faixa de temperatura empregada. A Tabela 7.3, o Gráfico 7.3 e os Cromatogramas 7.1.a,b e 7.2.a,b,c evidenciam essas afirmações. Finalmente, a Tabela 7.4 mostra que nmax, Hmin e Fo (vazão ideal) dependem inclusive da granulometria do suporte. Tabela 7.1 - Efeito do comprimento da coluna e da concentração da FE sobre a eficiência. Coluna * Vazão Ideal l (m) C (%) m (g) Fo n x 10-3 H (mm) (mL/min) 1 2 4 9 16 4 4 4 4 10 10 10 10 10 1 2 5 20 0,13 0,24 0,57 1,24 2,15 0,05 0,12 0,26 1,18 30+5 20+5 28+5 21+5 38+5 18+5 26+5 34+5 37+5 0,8 1,4 4,3 8,0 16,0 1,9 2,0 2,7 3,3 1,25 1,43 0,93 1,13 1,00 2,11 2,00 1,48 1,21 (*) a) Fase estacionária: Apiezon L; DE = 1/8”; DI = 2,04 mm; Suporte: Chromosorb P; 60-80 mesh b) l = comprimento da coluna; C = conc. da FE; m = massa da FE na coluna. Alexandre Schuler - Cromatografia 20 Tabela 7.2 - Efeito do volume injetado sobre L, n e H. Volume (µL) L (mm) n H (mm) 0,5 1,0 1,5 2,0 7 9 11 12 15.800 9760 6800 5270 1,01 1,64 2,35 3,03 Tabela 7.3 - Efeito da temperatura sobre o tempo de retenção Composto 70oC 100oC 130oC 160oC n-pentano 1,60 1,17 0,85 0,68 n-hexano 3,29 1,93 1,23 0,77 n-heptano 7,38 3,65 1,92 1,35 n-octano 18,88 7,08 3,25 2,00 A partir dessas informações é possível estabelecer, por exemplo, para uma coluna com 1/8” de diâmetro externo (coluna analítica), que: ♦ Para uma mesma FE, mesmo suporte e mesma granulometria, nmax é função linear de l. ♦ O valor de nmax aumenta, quando diminui a granulometria do suporte. ♦ O valor de nmax varia com C, sendo máximo quando C = 12 %, para suporte com faixa de granulometria de 60-80 mesh ( ≡ malhas por polegada linear; equivale a um diâmetro de partícula de 175-230 mm). ♦ A faixa de vazão ideal não varia com a temperatura. Alexandre Schuler - Cromatografia 23 Tabela 7.4 – Efeito da granulometria do suporte sobre a eficiência Malha/polegada nmáx Hmín Fo (mL/min) 60-80 4300 0,93 20 80-100 4600 0,87 20 100-120 5700 0,70 24 D.E. = 1/8”; l = 4 m; C = 10 % 7.3. Validação de um método analítico 7.3.1. Objetivo A identificação por Cromatografia (a gás ou a líquido) é feita por comparação dos tempos de retenção, para uma dada substância, entre uma solução padrão e a amostra. Entretanto, é sabido que num determinado sistema cromatográfico (Fase Móvel, Fase Estacionária e Detetor), mesmo empregando-se como fluxo da Fase Móvel aquele considerado ideal (de acordo com os experimentos de van Deemter), não é nula a probabilidade de outro componente da amostra apresentar o mesmo tempo de retenção que o da substância de interesse. Validar um método analítico consiste em garantir que nas condições analíticas, a substância-problema e apenas ela apresenta aquele tempo de retenção. Evidentemente um método validado deve ser operacionalizado através de um manual (Norma), o qual determina condições padronizadas que garantam a sua repetibilidade/reprodutibilidade. Deve ser enfatizado que um determinado método analítico validado para um determinado tipo de amostra não é necessariamente válido para outro tipo de amostra (ex.: dosagem de um princípio ativo existente em um determinado medicamento versus a mesma determinação nas vísceras do cadáver de uma suposta vítima de superdosagem), posto que outro tipo de amostra pode conter outras substâncias também Alexandre Schuler - Cromatografia 24 passíveis de ser detectadas no mesmo tempo de retenção do analito e que não tenham sido incluídas na pesquisa de validação. 7.3.2. Conceitos Com o objetivo de garantir uma correta compreensão deste texto, são apresentados a seguir os termos técnicos aqui empregados, com suas respectivas definições. Nome notação descrição Analito Substância-problema. Amostra Qualquer material, independentemente de sua origem, que contenha o analito. Padrão O analito, comercializado com alta pureza. United States Pharmacopea USP Farmacopéia Americana. Fonte de consulta. Concentração c Concentração do analito (ou do padrão). Solução Estoque SE Solução do padrão a alta concentração (pode ser guardada por alguns meses, dependendo da natureza da substância). Solução Intermediária SI Solução do padrão, necessária para se chegar à Solução de Trabalho. Solução de Trabalho ST Solução do padrão com concentração semelhante ao que se espera da amostra. Faixa de Linearidade FL Intervalo de concentração em que existe relação linear com a área do pico. Curva de Calibração Curva construída com os dados da Faixa de Trabalho. Coeficiente de Correlação r Parâmetro que mede a precisão com que a Curva de Calibração relaciona as áreas com as respectivas concentrações. É usado para avaliar o fim da região linear na construção da FL. Faixa de Trabalho FT Intervalo contido na FL, compreendendo as concentrações usuais da amostra. Limite de Detecção do Equipamento LDE Concentração mínima detectável do analito no extrato injetado. Limite de Detecção da Amostra LDA Concentração mínima detectável do analito na amostra. Limite Efetivo LE Concentração mínima do analito que corresponde a um erro máximo aceitável. Seletividade α Capacidade de separar a substância-problema dos demais componentes da amostra. Alexandre Schuler - Cromatografia 25 Resolução Rs Mede a seletividade. Precisão Avalia a repetibi l idade ou a reprodutibilidade de um método analítico, por medida da 1a ou da 2a estimativa do desvio-padrão (Apêndice 6). Exatidão Grau de fidelidade com que o resultado exprime o valor real da concentração do analito. Avaliado com auxílio do teste t1 (de Student), por comparação com uma solução padrão (Apêndice 6). Recuperação Nos casos em que se faz uma extração, é necessário determinar o percentual de extração e sua repetibilidade. Recomenda- se que a solução padrão seja submetida à mesma operação. Repetibilidade Mede a dispersão dos resultados obtidos por repetição da análise, num mesmo Laboratório, com o mesmo equipamento e mesmo analista. Ver Precisão. Reprodutibilidade Mede a dispersão dos resultados obtidos por repetição da análise, em diferentes Laboratórios, diferentes equipamentos ou diferentes analistas. Usa o teste F (Apêndice 6). Consistência Mede a influência sobre a repetibilidade, das diversas operações constantes do método. Robustez Mede a influência sobre a Reprodutibilidade, das diversas operações constantes do método. 7.3.3. Procedimento a) Seletividade / Identificação A principal fase do trabalho é aquela em que é testada a confiabilidade da identificação. Isso inclui a determinação do tempo de retenção de toda e qualquer substância que possa eventualmente existir na amostra, quais sejam: ♦ impurezas de síntese (no caso de produtos naturais, esse trabalho poderá ser bastante penoso); ♦ impurezas de degradação (essas informações podem ser obtidas de estudos shelf-life); ♦ excipientes, conservantes, aditivos e outros princípios ativos constantes da formulação (no caso de associações); Alexandre Schuler - Cromatografia 28 Desse modo, é de se esperar que o precursor (AS) seja um contaminante comum no produto (AAS). Conseqüentemente, o AS é uma das substâncias que devem ter seu tempo de retenção medido, para verificar se coincide ou não com o do AAS. Uma vez completada a etapa de identificação (vale repetir: confirmação de que nada que eventualmente possa estar presente na amostra apresente o mesmo tempo de retenção do AAS), parte-se para as avaliações estatísticas. i. Condições analíticas: ♦ Cromatógrafo a líquido modelo CG 480E, com detetor de ultravioleta CG 437B. ♦ Comprimento de onda: 254 nm. ♦ Coluna: RP-18, 250 mm X 4,6 mm, 10 µm; temperatura ambiente. ♦ Fase Móvel: H2O:Metanol:Ácido Acético (52,5:46:1,5); 1,5 mL/min (isocrático). Preparação das soluções padrão (para AAS e AS): A solução estoque foi de 500 mg/100 mL. As demais soluções foram de 200 mg/100 mL, 100 mg/100 mL, 20 mg/100 mL, 10 mg/100 mL e 5 mg/100 mL. Preparação da amostra: A partir de 5 comprimidos pulverizados em almofariz, foi tomada uma alíquota pesando 55 mg (10% do peso médio de um comprimido). O material foi dissolvido em 10 mL da fase móvel, com auxílio de ultra-som e em seguida filtrado (0,46 µm). Injeção da amostra: válvula Rheodyne, com loop de 20 µL. ii. Faixa de Linearidade e Limite de Detecção As soluções padrão foram injetadas em triplicata, sendo que a mais diluída foi injetada dez vezes. A partir das médias das áreas obtidas, foram construídas as respectivas Faixas de Linearidade (Gráficos 7.4 e 7.5), onde se evidencia que as massas injetadas conforme prescrito em Preparação da amostra permanecem dentro da região linear. O ruído (medido com atenuação Alexandre Schuler - Cromatografia 29 mínima necessária para uma altura não inferior a 5 mm) foi de 7 mm, o que por comparação com a média das alturas dos picos das dez injeções da solução mais diluída resultou em um Limite de Detecção (para AAS e AS), da ordem de 0,3 mg/100 mL. 0 500 1000 1500 2000 0,0 2,0x102 4,0x102 6,0x102 8,0x102 r = 0,99996 Á re a do p ic o Concentração (mg/L) 0 100 200 300 400 500 0 100 200 300 400 r = 0,99999 Á re a do p ic o Concentração (mg/L) Gráfico 7.4 – FLD do AAS. Gráfico 7.5 – FLD do AS. iii. Precisão e expressão dos resultados A partir dos dados (áreas) das dez injeções da solução mais diluída referida no item ii acima, pode ser calculado o erro analítico (de repetibilidade) e a partir deste (no exemplo, foi 1,2%), determinar a forma correta de expressão do resultado (forma esta válida para ambos os compostos): Re = X ± 0,01 mg/L Alexandre Schuler - Cromatografia 30 8 – TÉCNICAS ADICIONAIS DE IDENTIFICAÇÃO 8.1. Tempo de retenção e retenção relativa A identificação é feita tradicionalmente através da medição do tempo de retenção (tr). Entretanto, a essa forma de medição está associado um erro, decorrente de uma natural variação no tempo transcorrido entre a injeção e o acionamento do sistema de registro. Esse erro costuma ser da ordem de 2 % em relação ao tempo de retenção. É pequeno demais, na maioria das vezes. Mas há casos em que a diferença de tr entre dois componentes é dessa mesma ordem de grandeza. Em tais casos é recomendável o emprego da Retenção Relativa (RR). Um dos componentes é tomado como referência (RR = 1) e as RR’s dos demais são calculadas com auxílio da relação: RRb = trb/tra , onde tra e trb são, respectivamente, os tempos de retenção da referência e de outro componente. 8.2. Índice de retenção Outro parâmetro utilizado para identificação, o Índice de Retenção (Ir) é determinado experimentalmente a partir do cromatograma da mistura do desconhecido (i) com duas parafinas normais com n e m (m = n + 1) átomos de carbono, desde que: Vrn < Vri <Vrm onde Vr = volume de retenção = F.tr A relação: Iri = 100 [(Log Vri – Log Vrn) ÷ (Log Vrm – Log Vrn)] + 100 n pode ser substituída por: Iri = (Log Dri – Log Drn) ÷ (Log Drm – Log Drn) + 100 n Nesse sistema, assume-se que: Ir(H2) = 0,00 e Irn = 100 n Padrões para determinação do Ir : a) como visto acima, as parafinas normais são, por definição, padrões primários, com Ir = 100n. b) em qualquer série homóloga com mais de 5 átomos de carbono, o Ir cresce de 100 unidades para cada CH2 adicional e não é influenciado pela temperatura. Esses compostos podem, portanto, ser utilizados como padrões secundários. 8.3. Equivalência entre fases estacionárias