Baixe Apostila de Técnica de Coloração em Gram e outras Notas de estudo em PDF para Microbiologia, somente na Docsity! Ministério da Saúde Secretaria de Políticas de Saúde Programa Nacional de DST e Aids Técnica de Coloração de GRAM Brasília 2001 MINISTÉRIO DA SAÚDE José Serra Ministro de Estado da Saúde Cláudio Duarte Secretário de Políticas de Saúde Paulo Roberto Teixeira Coordenador Nacional de DST/AIDS-MS Miriam Franchini Coordenadora de Produção do Projeto TELELAB Autores: Cláudia Renata Fernandes Martins José Antônio Pinto de Sá Ferreira Luiz Fernando de Góes Siqueira Luís Alberto Peregrino Ferreira Maria Luísa Bazzo Miriam Franchini Oscar Jorge Berro Sílvio Valle Assessoria Pedagógica: Maria Lúcia Ricciotti Ribinik Martistela Arantes Marteleto Técnica de Coloraçao de Gram. Brasilia: Ministerio da Saúde, Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS, 1997. 63 p.: iI. (Série TELELAB) 1. Gram I. Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS, (Brasil). II. Série TELELAB PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de Coloração de Gram APRESENTAÇÃO.........................................................................................................................6 INTRODUÇÃO E MODIFICAÇÕES AO MÉTODO DE GRAM.....................................9 PREPARAÇÃO DOS CORANTES E TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM...................................................................................................................................................15 material necessário para preparar os corantes..................................................................17 preparação da violeta-de-metila....................................................................................18 preparação do lugol e da safranina.................................................................................19 armazenamentos dos corantes.......................................................................................20 técnica de coloração de Gram......................................................................................20 PRINCÍPIO DE FUNCIONAMENTO.................................................................................23 CONTROLE DE QUALIDADE.............................................................................................27 RESULTADOS..........................................................................................................................31 FÓRMULAS................................................................................................................................37 BIOSSEGURANÇA........................................................................................................41 - 63 CONSIDERAÇÕES FINAIS...................................................................................................57 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de Coloração de Gram Agora você faz parte do Sistema de Educação a Distância para profissionais da saúde envolvidos com o diagnóstico laboratorial das Doenças Sexualmente Transmissíveis e Aids - DST/AIDS - TELELAB. O TELELAB foi criado para levar até você cursos com informações indispensáveis para que seu trabalho seja realizado dentro dos padrões de qualidade estabelecidos pelo Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e Aids, do Ministério da saúde - PN-DST/AIDS-MS. Assistindo ao programa de vídeo e estudando este manual você terá a oportunidade de verificar o que pode ser mudado no seu dia-a- dia e o que pode ser mantido. Assim, você terá mais confiança nos resultados do seu trabalho e mais tranqüilidade no que se refere à sua segurança pessoal. GUARDE ESTE MANUAL PARA CONSULTAR SEMPRE QUE NECESSÁRIO. ELE É SEU. USE-O! Para esclarecimentos de dúvidas e sempre que precisar, comunique-se diretamente com TELELAB - PN-DST/AIDS-MS Telefax gratuito: 0800 - 61 - 2436 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de Coloração de Gram Ao final deste curso você será capaz de: • identificar os procedimentos e técnicas recomendados pelo PN-DST/AIDS - MS para preparação dos corantes e para a realização da coloração Gram; e • executar a coloração de Gram, obedecendo aos critérios técnicos, critérios de controle de qualidade e cuidados de biossegurança recomendados. Funcionamento do seu curso TELELAB Agora que você fez a inscrição e o pré-teste, está na hora de se organizar para fazer seu curso! Você tem1mês para concluí-lo. Assista ao vídeo quantas vezes você precisar. No manual, estão todos os conteúdos para o seu estudo. Faça o pós-teste e responda ao questio- nário de avaliação. Suas informações são fundamentais para a melhoria do TELELAB. Para obter o certificado, você deverá acertar no minímo 80% do pós-teste. Depois da correção do seu teste pelo PN-DST/AIDS, você receberá o certificado. Inscrição Pré-teste Vídeo e Manual Pós-teste Certificado 11 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de coloração de GRAM Introdução O método tintorial predominante utilizado em bacteriologia é o método de Gram. A bacterioscopia, após coloração pelo método de Gram com diagnóstico presuntivo, de triagem, ou até mesmo confirmatório em alguns casos, constitui peça importante e fundamental na erradicação e no controle das Doenças Sexualmente Transmissíveis (DST). Essa técnica é simples, rápida e tem capacidade de resolução, permitindo o correto diagnóstico em cerca de 80% dos pacientes em caráter de pronto atendimento em nível local. Os custos com investimento e manutenção são consideravelmente baixos diante da eficácia alcançada com os resultados imediatos dos testes. Essa técnica requer instalação simples, necessitando apenas de uma sala pequena com disponibilidade de água e gás, onde deverá ser instalado um balcão com pia e um bico de Busen, eventualmente substituído por uma lamparina ou espiriteira. São ainda necessários: microscópio com objetiva de imersão e bateria para a coloração de Gram. Os corantes devem ser preparados pelo próprio laboratório ou por um laboratório habitado que assegure a qualidade do produto. Finalmente, e mais importante, são necessários técnicos de laboratório treinados, responsáveis e conscientes do valor do seu trabalho. A coloração de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bactérias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificá-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram- positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas. Após descrição do método, inúmeras propostas de modificação foram feitas. Neste manual, você vai conhecer a técnica, os corantes e os procedimentos para a correta realização da coloração de Gram, recomendados pelo Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e Aids do Ministério da Saúde. 12 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de coloração de GRAM Quais as modificações feitas ao método de Gram? O método original utilizava violeta-de-genciana. Hoje se utiliza um outro tipo de cristal violeta, a violeta-de-metila. É importante ressaltar que a solução de violeta-de-metila, em sua preparação, já contém fixador químico. Devido a isso, a fixação do esfregaço em chama caiu em desuso e é atualmente contra-indicada. O diferenciador há 100 anos era uma mistura de solventes. Hoje se usa apenas o álcool etílico (99,5º Gay Lussac). Este é mais seguro do que o álcool acetona utilizado por HURK, que requeria grande habilidade do operador para que não ocorresse a hiperdescoloração. Além do que, não permitia uma boa reprodutibilidade da técnica. Entretanto, a modificação mais importante foi a do corante secundário, também chamado de corante de fundo. A fucsina fenicada de Gram foi substituída pela safranina. Foi baseado no espectro de cores que substituiu a fucsina pela safranina. A safranina mantém-se mais distante da violeta no espectro de cor, diferenciado com maior nitidez as bactérias Gram-negativas que se destacam das Gram-positivas e da coloração de fundo, que assume a cor vermelho-claro. Veja a figura 1, na página seguinte: P R E PA R A Ç Ã O D O S C O R A N TE S E T É C N IC A D E C O LO R A Ç Ã O D E G R A M 17 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de coloração de GRAM O que é preciso para preparar os corantes de Gram? Para preparar os corantes, você vai precisar de: • 1 béquer de 500 ml; • 1 béquer de 1 litro; • 1 balança gramatária ou eletrônica; • 2 bastões de vidro; • 1 proveta de 200 ml; • 1 proveta de 500 ml; • 1 espátula ou uma colher de café; • violeta-de-metila; • álcool etílico (99,5º Gay-Lussac) • álcool metílico (99,5º Gay-Lussac) • axalato de amônia; • iodeto de potássio; • iodo metálico; • safranina; e • água destilada. 20 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de coloração de GRAM Como armazenar os corantes? Os recipientes utilizados para os corantes devem ser de cor âmbar- escuro, pois, de forma geral, as substâncias corantes sofrem ação da luz, produzindo alterações variadas. Os corantes devem ser colocados em frascos de 1 litro e distribuídos em frascos conta-gotas com cerca de 100 ml de capacidade, para uso diário. Sempre que os frascos conta-gotas forem reabastecidos, filtre o corante. Este procedimento evitará os inconvenientes advindos da precipitação do corante. Como fazer a coloração de Gram? Antes de iniciar a coloração, assegure-se de que o esfregaço esteja seco. Não fixe o esfregaço em chama, pois este processo promove a desidratação brusca dos constituintes celulares. Lembre-se de que a violeta- de-metila já contém fixador químico. Para fazer a coloração, siga os seguintes passos: 21 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de coloração de GRAM 1. Cubra o esfregaço com violeta-de-metila e deixe por aproximadamente 15 segundos; 2. Adicione igual quantidade de água sobre a lâmina coberta com violeta-de-metila e deixe agir por mais 45 segundos; 3. Escorra o corante e lave em um filete de água corrente; Cubra a lâmina com lugol diluído (1/20) e deixe agir por aproximadamente 1 minuto; 4. Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente; 5. Adicione álcool etílico (99,5º GL) sobre a lâmina; descorando-a, até que não desprenda mais corante; 6. Lave em um filete de água corrente; 7. Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos; 8. Lave em um filete de água corrente; 9. Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com o auxílio de um papel de filtro limpo; 10. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço; e 11. Leia em objetiva de imersão (100 X). Figura 1: material para coloração de Gram. 25 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de coloração de GRAM Como funciona a coloração de Gram? Desde o trabalho original de Hans Gram, vários pesquisadores tentaram, com pouco sucesso, determinar o mecanismo envolvido no método de coloração. Conceitos diversos têm sido apresentados, tais como: 1. A existência de um substrato Gram-positivo e específico; 2. As bacté r ias Gram-pos i t i vas e Gram-negat ivas possuiriam diferentes afinidades com o corante primário cristal de violeta; e 3. A existência de diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos. Este último é o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da pare- de celular, quanto as dimensões dos espaços intersticiais, por exemplo, “diâmetro do poro”, parecem ser determinantes do resultado final da coloração de Gram. Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares são cobertas pela violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adição do lugol, também chamado de mordente, ocorre a formação do completo iodo-pararosanilina. Esta reação tem a propriedade de fixar o corante primário nas estruturas coradas. Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como álcool etílico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou não perdem a cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas. 26 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de coloração de GRAM As bactérias que têm a parede celular composta por mureína (peptídeoglicano - peptídeo de ácido n-acetil murâmico), durante o proces- so de descoloração com álcool etílico, retém o corante. Já as bactérias com parede celular composta predominantemente por ácidos graxos (lipopolissacarídeos e lipoproteínas) perdem o complexo iodo-pararosanilina, assumindo a cor do corante de fundo. Veja as figuras 1 e 2. Figura 1. Esquema da parede das bactérias Gram-positivas Figura 2. Esquema da parede das bacterias Gram-negativas Gram + Gram - peptídeoglicano (MUREÍNA) peptídeoglicano (MUREÍNA) membrana citoplasmática membrana citoplasmática espaço periplasmático membrana externa lipopolissacarídeo 30 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de coloração de GRAM Como preparar as lâminas de controle de qualidade para uso diário? Obedeça ao seguinte procedimento. Prepare uma suspensão de Streptococcus Pyogenes e Escherichia Coli. Para isso, pipete 2 ml de solução salina estéril em um tubo de ensaio limpo e estéril. Junte uma alçada do Streptococcus Pyogenes e outra de Escherichia Coli. Muita atenção com os procedimentos técnicos e cuida- dos de biossegurança durante a execução. Flambe a alça bacteriológica antes e após a utilização com cada uma das cepas bacterianas. Não se esqueça de esfriar a alça após a flambagem. Prepare 30 lâminas para utilizar durante 1 mês, pipetando uma gota da suspensão bacteriana sobre cada uma das lâminas de vidro, limpas, secas e desengurduradas. Deixe as lâminas secarem naturalmente. Estoque-as em um porta-lâminas em temperatura ambiente. Lembre-se de identificar o porta-lâminas. O controle de qualidade deverá sempre ser realizado ao término da preparação dos corantes, mesmo que seja uma simples diluição, como no caso do lugol e todas as vezes que o procedimento de coloração for realizado. 35 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de coloração de GRAM Figura 5: Diplococos Gram-negativos intracelulares sugestivos de Neisseria gonorrhoeae. Figura 6: Bacilos Gram-negativos intracelulares sugestivos de Haemophilus ducreyi. Fó rm u la s 45 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Use sempre Equipamento de Proteção Individual (EPI): avental ou jaleco longo de mangas compridas e punho retrátil, luvas descartáveis, óculos de proteção, pipetadores manuais ou automáticos e, quando for o caso, protetor facial. Os EPI são regulamentados pelo Ministério do Trabalho e seu uso visa a minimizar a exposição do técnico aos riscos e evitar possíveis acidentes nos laboratórios. Note que, às vezes, os profissionais de laboratório precisam de um tempo para se adaptar ao uso dos equipamentos na sua rotina. O importante é que você se adapte e incorpore a utilização dos EPI à sua prática profissional. O uso indevido dos EPI, ao invés de proteger, poderá ocasionar acidentes. Figura 2. Ilustração dos principais Equipamentos de Proteção Individual (EPI) 46 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Evite a formação e dispersão de aerossóis. Aerossóis são micropartículas sólidas e líquidas com dimensões aproximadas entre 0,1 e 50 micra que podem, caso contenham microorganismos, permanecer em suspensão e plenamente viáveis por várias hora. A pipetagem, flambagem de alças, abertura de frascos e ampolas, manipulação de seringas, agulhas, lancetas, lâminas e outros assemelhados podem gerar e propagar aerossóis. Abertura de frascos, ampolas, tubos e garrafas de cultura requer cuidados especiais. Envolva a parte a ser aberta com um pedaço de gaze. Utilize um pedaço de gaze para cada material, prevenindo assim a contaminação cruzada. Descarte-a imediatamente em hipoclorito de sódio a 2 %. Centrífugas, agitadores e maceradores, quando manipulados sem as precauções e abertos antes da total parada ou término da operação, igualmente podem contaminar o ambiente laboratorial. 47 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Jamais reencape agulhas. Esse procedimento é uma das principais causas da contaminação de profissionais de saúde por microorganismos, existentes no sangue e em outros fluidos orgânicos, como por exemplo, o vírus da hepatite B e o HIV. Após a coleta, você deve descartar esse material diretamente em recipiente de paredes rígidas com tampa, contendo hipoclorito de sódio a 2 % em volume superior a metade do recipiente. Lembre-se: Cada mililitro de sangue contaminado com o vírus da hepatite B contém 100.000.000 de partículas virais, que podem permanecer viáveis por até uma semana. Basta uma dessas partículas para contaminar a pessoa. Figura 3. Ilustração do descarte de agulha em recipiente apropriado 50 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Figura 5. Principais símbolos internacionais associados aos riscos em laboratórios. 51 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Verifique sempre as condições de funcionamento dos equipamentos de Proteção Coletiva (EPC): extintores de incêndio, chuveiros de segurança, lava-olhos, pia para lavagem de mãos, caixa de areia e cabine de segurança biológica. Existem três tipos de cabines de segurança biológica disponíveis no mercado: as de classe I, classe II e classe III. São recomendadas para o uso em laboratórios clínicos as de classe II. Veja a figura , na página seguinte. Procedimentos que devem ser observados na cabine de segurança biológica: Descontamine a superfície interior, antes e depois do uso, com gaze estéril embebida em desinfetante adequado; Ligue a cabine e a luz ultravioleta 20 minutos antes e deixe tudo ligado pelo mesmo tempo ao final de sua utilização; Use avental de mangas longas, luvas descartáveis e máscara; Não efetue movimentos rápidos ou bruscos dentro da cabine e evite operações que causem turbulência; Não use bico de Bunsen, pois pode acarretar danos ao filtro HEPA e causar desequilíbrio do fluxo de ar. Se necessário, use incinerador elétrico ou microqueimador automático; e Mantenha as grelhas anteriores e posteriores da cabine desobstruídas. A cabine não é um depósito. Evite guardar equi- pamentos ou quaisquer outros objetos no seu interior. 52 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Figura 6. Ilustração das cabines de segurança biológica - classes I, II e III. As cabines de classe I e II são consideradas como barreira de proteção parcial e a de classe III é uma barreira de proteção total. CLASSE I CLASSE II CLASSE III 55 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Tenha muito cuidado com a manipulação e estocagem de substâncias químicas. Leia com atenção as informações contidas nos rótulos. A estocagem de matéria-prima deve ser feita em armários apropri- ados, bem ventilados, ao abrigo da luz solar e calor. É importante obser- var a incompatibilidade entre as diferentes substâncias. Sempre que recomendado pelo fabricante, os agentes químicos devem ser manipulados em capelas de exaustão química devidamente instaladas. Atenção: Não confunda capela de exaustão química com cabine de segurança biológica. Veja a seguir os riscos relacionados a cada categoria química: Categoria química e riscos relacionados Grupo químico Risco Ácidos Corrosão Bases Corrosão Cianetos e Sulfetos Envenenamento Líquidos inflamáveis Incêndio Sólido Inflamável Incêndio 56 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Seja sempre consciente da importância de suas ações na preservação da biossegurança em seu local de trabalho: Lave as mãos antes e depois de qualquer procedimento laboratorial; Nunca pipete com a boca; Jamais cheire placas de cultura; Dentro do laboratório, não fume, não coma, não beba, não prepare refeições; Quando estiver usando luvas, não manuseie objetos de uso comum, como telefones, maçanetas de portas e janelas, jornais, revistas etc; Não guarde alimentos ou bebidas em geladeiras e congeladores para armazenagem de material biológico; e Vacine-se rotineiramente contra a hepatite B. Seguindo essas recomendações, você vai estar contribuindo para a diminuição de acidentes. Se acontecer um acidente de trabalho em seu laboratório, notifique imediatamente a sua chefia. 57 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de coloração de GRAM Muitas das atividades aqui descritas já fazem parte do seu cotidiano. Faça uma reflexão sobre o que acabou de ler e verifique o que pode ser mantido, modificado e incorporado a seu trabalho e ao seu laboratório para que a sua prática profissional se desenvolva de acordo com os procedimentos técnicos e cuidados de biossegurança recomendados pelo Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e Aids, do Ministério da Saúde. As questões colocadas a seguir facilitarão essa reflexão. CONSIDERAÇÕES FINAIS 60 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Segurança geral O laboratório é devidamente fechado e seguro quando não está ocupado? As portas e janelas são mantidas devidamente fechadas? Os materiais tóxicos e equipamentos de risco são estocados em área segura? Prevenção de incêndio Existe sistema de alarme? As passagens pelas portas de emergência estão desobstruídas? O sistema de detecção de incêndio está em bom funcionamento e é regularmente testado? Existe sinalização de emergência? Existem extintores de incêndio para os diversos tipos de materiais e em quantidade suficiente? Os extintores estão dentro do prazo de validade? Existe sinal de “não fumar” na área de laboratório? A equipe está treinada em combate a incêndio? Estocagem de líquidos inflamáveis O local está separado do prédio principal? Existe ventilação suficiente para retirar vapores? O local está devidamente sinalizado? Existem lâmpadas seladas para proteção contra ignição nos vapores? Existe advertência de “não fumar”? 61 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Risco com eletricidade As instalações estão de acordo com os padrões estabelecidos pela ABNT? Existe fio de terra? Os equipamentos estão devidamente aterrados? Os equipamentos com potencial de risco de desligamento estão devidamente ligados a um circuito de emergência para os casos de queda ou interrupção de energia? Os cabos de conexão aos diversos equipamentos estão em perfeito estado de manutenção? Cada equipamento está ligado em uma tomada; evita-se o uso de benjamim? Todas as tomadas têm sua voltagem identificada? Você sabe onde fica o quadro-geral de força da sua unidade? Gases e líquidos comprimidos Os diversos tipos de gases estão devidamente identificados? Os cilindros possuem válvulas de segurança? Existe advertência de não-utilização de óleo nas válvulas? Os cilindros estão devidamente seguros contra quedas? Existe ventilação suficiente para evitar a formação de bolsões de gases e explosões? Proteção pessoal Existem em quantidade suficiente: Lava-olhos? Chuveiros de emergência? Proteções contra radiações, incluindo os dozímetros? Máscara contra partículas? Luvas descartáveis? Pipetadores manuais e/ou automáticos? Óculos de proteção e outros? 62 PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Biossegurança Segurança e saúde ocupacional Existe serviço de saúde ocupacional? Existe caixa com materiais para primeiros-socorros? Existem profissionais treinados em primeiros-socorros? Existem informações sobre como agir em caso de emergência, tais como: telefone de hospitais, pronto-socorros e bombeiros? Existe um programa de vacinação atualizado? Existe sinalização educativa para prevenir o risco? Equipamento de laboratório Os equipamentos estão validados e certificados quanto a seu uso? Existe procedimento de desinfecção de equipamentos antes de enviá-los à manutenção? As cabines de segurança biológica e química são regularmente testadas? As autoclaves estão validadas? As centrífugas, rotores e frascos têm seus tempos de utilização devidamente anotados? Vidrarias quebradas e trincadas são descartadas? Existem recipientes adequados para descartar frascos quebrados e material perfurocortante? As capelas de exaustão para manipulação estão devidamente sinalizadas? Suas balanças estão certificadas pelo Inmetro? Seus congeladores, geladeira, fornos, estufas ou equipamentos termo-regulavéis possuem sinais de controle e registro de temperatura? PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de Coloração de Gram REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BARON, E.J. & FINEGOLD, S.N,, Appendix B, Formúlas for commonly used stains. In: Bailey and Scott’s diagnostic microbiology, 8º ed. St. Louis, 1990. Mosby. BARON, E.J,; PETERSON, L.R. & FINEGOLD, S.N,, Optical methods for laboratory diagnosis of infectious diseases. In: bailey and Scott’s diagnostic microbiology, 9º ed.st.Louis, 1994, Mosby. BARTHOLOMEW, J.W., CROMWELL, T. & GAN, R.. Analysis of the mechanism of Gram differentiaton by use of filter paper chomatographic Technique. J.Bacteriol, 90:766, 1965. BOTTONE, E.J. The gram stain: The century-old quintessential rapid diagnostic test. Lab. Med. 19:288, 1988. CLARRINDGER, J.E. & MULLINS, J.M. Microscopy and Staining. In: Howard, B,J.; Klass, J. II & Rubin, S.J.eds. Clinical and Pathogenic Microbiology, 1987. Mosby. ST.Louis. DAVIES, J.A., ANDERSON, G.K. & BEVERIDGE, T.J. Chemical mechanism of the Gram stain and Synthesis of a new electron-opac marker for eletron microscopy which replaces the idione mordant of the stain. J. Bacteriol. 156:837, 1983. DOUGLAS, S.D. Microscopy. In: Lenette, E.H.,editor. Manual of Clinical Microbiology, 4º ed. Washington D.C., 1985, American Society for Microbiology. MANGELS, J.I., COX, M.E. & LINDENBERG, L.H. Methanol fixation: an alternative to heat fixation of smears before staning. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2: 129, 1984. RICE-SPEARMAN, L. The Gram Stain: Still a diagnostic tool? Clin. Lab. Sci. 6: 16, 1993. PN-DST/AIDS/Ministério da Saúde Técnica de Coloração de STAINIER, R.Y.; DOUDOROFF, M. & ADELBERG, E, Metodos de coloraciones, In: Microbiologia. 2º ed.Madrid,1977, Aguilar S. de ediciones. FRANCHINI, MIRIAM, Procedimentos Laboratoriais no Controle das Doenças Sexualmente Transmissíveis, Brasília, 1983, Senado Federal- Centro Gráfico. TEIXEIRA, PEDRO & VALLE, SILVIO. Biossegurança - Uma abordagem Multidisciplinar. Rio de Janeiro , 1996, Editora FIOCRUZ. CURA, E. WENDEL, S., 1994, Manual de Procedimentos de controle de Calidad para los laboratórios de Serologia de los Bancos de Sangue. Organización Panamericana de la salud (OPS). Washington, DC, 61 p. GRISHT, N.R., 1995. Manual de Segurança para Laboratório. Eitora Santos , São Paulo, 133p. VALLE,S. & TEIXEIRA, P., 1996. Biossegurança: Uma abordagem multidisciplinar. Editora FIOCRUZ, Rio de Janeiro, 362p. COSTA, M.F., 1996. Segurança Química em Biotecnologia e Ambientes Hospitalares. Editora Santos, São Paulo, 99p. VALLE,S. 1996, Regulamentação da Biossegurança em Biotecnologia. Edição Curso de Biossegurança da FIOCRUZ, Rio de Janeiro, 80p. SIMONS,J. & SOTTY,P., 1991. Prévention el Laboratorie de Researche, Editions INSERM/INRA/ Institute Pasteur, Paris , 248p. Ministério da Saúde, 1994, Processsamento de Artigos e Superfícies em Estabelecimento de Saúde. 2º edição, Brasília, 49p. Ministério da Saúde, 1995, Segurança no Ambiente Hospitalar. Brasília, 196p. FLEMING, D.O. at al., 1995. Laboratory Safety: Principles and Practices, 2nd Ed. American Dociety for Microbiology. Washington, DC, 406 p. Agradecimentos: Às equipes da: Instituto de Saúde Pública do Distrito Federal - ISDF; Ao Laboratorio ControlBio, São Paulo; e ao Hospital Universitário - Universidade Federal de Santa Catarina-UFSC. Projeto Gráfico, Diagramação e Arte-final: Coordenação Nacional de DST e Aids