Artigo: Pesquisa em Biologia Molecular: Como fazer?

Artigo: Pesquisa em Biologia Molecular: Como fazer?

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Pesquisa em Biologia Molecular: como fazer? Mauro de Souza Leite Pinho

Vol. 26Nº 3Rev bras Coloproct Julho/Setembro , 2006

Pesquisa em Biologia Molecular: Como Fazer?

Molecular Biology Research - How to do it? MAURO DE SOUZA LEITE PINHO - TSBCP

RESUMO: O estudo da biologia molecular representa hoje uma das áreas de maior potencial para a realização de pesquisas em Medicina e um número cada vez maior de profissionais de saúde tem se interessado em aprofundar seus conhecimentos e produção científica, mediante a realização de projetos de pesquisa nesta área. Entretanto, a elaboração do projeto de pesquisa necessita ser realizada de forma bastante cuidadosa, considerando a grande amplitude dos potenciais objetivos e metodologias a serem utilizadas, dependentes em grande parte da disponibilidade de recursos tecnológicos e experiência prévia da equipe. O objetivo deste trabalho é contribuir para esta elaboração do projeto de pesquisa através da apresentação de alguns modelos estruturais mais freqüentemente utilizados na realização de estudos em biologia molecular, assim como rever seus princípios e métodos empregados.

Descritores: Pesquisa, biologia molecular.

PINHO MSL. Pesquisa em Biologia Molecular: como fazer?Rev bras Coloproct, 2006;26(3): 331-336.

O estudo da biologia molecular representa hoje uma das áreas de maior potencial para a realização de pesquisas na área médica, considerando-se não apenas sua grande relevância clínica e epidemiológica, mas também pela possibilidade de aplicação de ferramentas recentemente desenvolvidas a um número bastante amplo de doenças.

Em conseqüência do grande interesse despertado por esta área, observa-se um número cada vez maior de profissionais da área de saúde motivados em aprofundar seus conhecimentos e produção científica, mediante a realização de projetos de pesquisa, os quais de alguma forma utilizem conceitos e procedimentos relacionados á biologia molecular.

Entretanto, já aos primeiros passos neste caminho o candidato a pesquisador defronta-se com questões bastante complexas referentes não apenas à escolha do tema a ser estudado, mas principalmente á definição de seus objetivos gerais, específicos ou mesmo aos recursos adequados e/ou disponíveis para a execução de sua metodologia.

Assim sendo, o objetivo deste texto será apresentar uma breve revisão de conceitos básicos sobre a biologia molecular, confrontando-os com a respectiva

Trabalho realizado na Disciplina de Clínica Cirúrgica - Univille - Joinville - SC - Brasil.

Recebido em 01/06/2006 Aceito para publicação em 08/08/2006 seqüência de potenciais áreas e metodologias de pesquisa.

Até algumas décadas atrás, o estudo dos tecidos vivos baseava-se quase que exclusivamente em observações de natureza morfológica, fossem estas a nível macroscópico ou microscópico. Desta forma, a análise das alterações ocorridas na intimidade destes tecidos poderiam ser identificadas apenas mediante a constatação de seus efeitos sobre sua estrutura, a qual iria apresentar modificações em sua forma, tamanho, aparência e outras variáveis.

O grande e acelerado desenvolvimento da tecnologia permitiu que estes mesmos tecidos fossem posteriormente analisados em seu conteúdo submicroscópico, ou seja, através da identificação das moléculas que os compõem pela aplicação de métodos químicos ou físicos.

O grande salto de conhecimento ocorrido nesta área foi proporcionado pelos trabalhos pioneiros de Watson e Crick, na década de 50, os quais, ao definir a estrutura química da molécula de DNA, estabelece-

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Vol. 26Nº 3Rev bras Coloproct Julho/Setembro , 2006 ram a principal diferença entre os seres vivos e a matéria inanimada.

A partir deste achado, sucedeu-se uma seqüência de descobertas que demonstrou que esta molécula representava o elemento primordial, a partir do qual poderíamos compreender as principais características dos seres vivos. Nascia a biologia molecular.

A identificação da molécula de DNA possibilitou uma melhor compreensão do ciclo finito da vida, descrito como o intervalo entre os processos de nascimento e morte, e mantido através de um constante funcionamento baseado na ação de moléculas, a qual seria o elemento básico das transformações morfológicas observadas de forma peculiar em cada ser vivo no reino animal ou vegetal.

Para melhor analisarmos o impacto destas descobertas, consideremos como elemento vivo uma única célula, mínimo organismo capaz de realizar as tarefas inerentes á vida como captação de energia e o metabolismo interno necessário durante o seu ciclo de existência.

Os estudos bioquímicos nos trouxeram o conhecimento de que as principais moléculas responsáveis pela realização destas tarefas são as proteínas. Estas macromoléculas, compostas por seqüências de aminoácidos, representam a maior parte de matéria seca de uma célula. Além de auxiliar a compor sua estrutura, as proteínas realizam praticamente todas as funções celulares, como enzimas, transporte, transmissão de sinais, recepção de estímulos e até a regulação da ativação de genes para a produção de outras proteínas.

Estima-se hoje que cada célula necessite para seu funcionamento vital de cerca de 10 0 proteínas diferentes, cada uma delas desempenhando uma tarefa específica.

Estas proteínas, como sabemos, são produzidas a partir de segmentos de seqüências gênicas no DNA, através da qual se estruturam moléculas de RNA, descritas como mensageiras (RNAm). Estas moléculas irão migrar a partir do DNA nuclear para os ribossomos, no citoplasma, onde, através de ligações com outra forma de RNA (descrito como transportador), irão realizar a síntese das proteínas mediante o encadeamento seqüencial de aminoácidos. Poderíamos então sumarizar esta seqüência de eventos da seguinte forma:

Estruturando um projeto de pesquisa em biologia molecular

Utilizando os conceitos acima revistos, discutiremos a seguir três tipos de projetos mais freqüentemente utilizados em biologia molecular:

1º tipo: Pesquisar no DNA de um indivíduo saudável o risco de desenvolver uma doença de caráter hereditário

Esta é certamente um dos tipos de projetos de pesquisa mais realizados, representando a base do estudo das doenças genéticas. Como exemplo clássico na área da Coloproctologia para este modelo de estudo, podemos citar a necessidade de identificar se um membro de uma família de um paciente portador de polipose adenomatosa familiar terá ou não o risco de desenvolver a mesma doença. Neste caso, sabemos que o gene responsável pela ocorrência desta doença é dominado como APC, cuja função é codificar uma proteína relacionada ao controle da atividade proliferativa da célula intestinal.

Para realizar este estudo, precisamos responder às seguintes perguntas:

·A seqüência deste gene APC em um DNA normal (sem mutações) já é conhecida ?

Sim, como a maior parte dos genes de relevância clínica, sua seqüência já é publicamente disponível em bases de dados facilmente acessíveis pela Internet;

·Já foi identificada a mutação existente no paciente portador da polipose ?

Provavelmente não. Neste caso, teremos necessariamente que fazer um sequenciamento de todo o gene APC deste paciente, em qualquer célula normal somática (ou seja, excluindo óvulos e espermatozóides), pois ao se tratar de uma mutação (também chamada

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de polimorfismo) provavelmente herdada geneticamente, esta deve estar necessariamente universalmente presente. Para esta finalidade, utiliza-se mais freqüentemente as células sanguíneas, cujo DNA é extraído.

Para realizar esta avaliação da seqüência de todo o gene, necessitaremos utilizar seqüenciadores eletrônicos, os quais nos permitirão determinar a seqüência de bases nitrogenadas (adenina, citosina, guanina e timina) no segmento desejado, conforme demonstrado na figura 1, e compará-la com a seqüência previamente conhecida.

Este é um procedimento ainda disponível em poucos centros, demorado e de alto custo, especialmente se considerarmos que o gene APC é bastante longo, contendo 8535 pares de bases nitrogenadas. Caso este exame seja possível, e tenha sido possível identificar uma mutação em algum segmento (como uma troca de uma adenina por timina, por exemplo), então estaremos aptos a prosseguir em nosso estudo.

·Como saber se um familiar assintomático apresenta a mesma mutação em seu DNA ?

Para isto, bastar extrair o DNA de algum tecido celular deste paciente (sangue, esfregaço da bochecha, etc) para pesquisar se esta mutação estará presente. Como neste caso já sabemos onde e qual a mutação a ser procurada, não necessitamos fazer um sequenciamento novamente. Para isto, podemos apenas utilizar uma técnica de amplificação do DNA denominada como reação em cadeia pela polimerase (PCR), a qual irá permitir a replicação in vitro em lar- ga escala apenas do segmento de DNA desejado, ou seja, aquele no qual está contida a seqüência que apresentou a mutação no familiar doente.

Caso o laboratório disponha de aparelhos de

PCR mais modernos (real-time PCR) esta identificação e mensuração dos segmentos a serem examinados poderá ser realizada eletronicamente, no chamadotempo real. Caso o aparelho de PCR não disponha deste recurso, o produto de sua amplificação deverá ser identificado posteriormente em gel de eletroforese (Figura 2). Como qualquer alteração na seqüência de DNA implicará uma alteração de seu peso molecular, será possível observar se a seqüência do segmento gênico examinado está íntegra ou não, pois o peso molecular do segmento normal é conhecido (Figura 3).

Este tipo de estudo é, portanto, utilizado quando desejamos conhecer a existência de uma alteração genética, hereditária ou não, e é usualmente descrito comopesquisa de polimorfismos.

2º tipo: Pesquisa de DNA estranho ao indivíduo em um tecido

Este tipo de estudo, de grande relevância na esfera da infectologia, é semelhante a este último apresentado acima, com a diferença de que o segmento de DNA pesquisado no tecido do indivíduo não é uma variação de uma seqüência gênica humana normal, mas uma seqüência presente exclusivamente em um determinado ser vivo de outra espécie, seja este um vírus ou bactéria, denotando assim a sua presença anômala.

Figura 2 - Gel de agarose contendo dez amostras teciduais, nas quais fragmentos de DNA podem ser identificados através de seu posicionamento decorrente de seu peso molecular.Figura 1 - Sequenciamento do DNA.

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Como exemplo, vamos definir como nossa hipótese que a ileite em um paciente portador de diarréia é causada pela presença de uma infecção por Yersinia enterocolitica. Neste caso, como poderemos utilizar as ferramentas da biologia molecular para fazer este diagnóstico ?

·Extração do DNA a partir de uma biópsia do íleo terminal colhida por colonoscopia

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