Cinetica Enzimatica

Cinetica Enzimatica

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ESTÁGIO DE DOCÊNCIA Cinética Enzimática

JULHO 2006

A Cinética de Reações Enzimáticas apresentam os seguintes objetivos: • Medir as velocidades das transformações que se processam;

• Estudar a influência de condições de trabalho (concentrações de reagentes e das enzimas, temperatura, pH, concentrações de ativadores e de inibidores) naquelas velocidades;

• Correlacionar (equações empíricas ou modelos matemáticos) as velocidades das transformações com alguns dos fatores que as afetam;

• Colaborar na otimização do processo;

• Estabelecer critérios para o controle do processo;

• Projetar o reator mais adequado.

1 Influência da concentração de substrato

Um dos fatores que afetam a velocidade de uma reação catalisada por uma enzima purificada é a concentração do substrato presente [S]. O estudo dos efeitos da concentração de substrato é complicado pelo fato de a [S] variar durante o curso de uma reação à medida que o substrato é convertido em produto. Uma forma de simplificar este problema é medir a velocidade inicial da reação (V0). Em um experimento cinético a [S] é sempre muito maior que a concentração da enzima [E], e se o tempo de reação é suficientemente curto, as mudanças da [S] serão negligenciáveis, podendo ser considerada como uma constante.

O efeito provocado em V0 pela variação da [S], quando a concentração de enzima é mantida constante está mostrado na Figura 1. Em concentrações pequenas do substrato, V0 aumenta quase linearmente com os aumentos de [S]. Em concentrações maiores de substrato

V0 aumenta por incrementos menores em respostas aos aumentos da [S]. Finalmente, é alcançado um ponto acima do qual ocorrem apenas aumentos insignificantes em V0, mesmo diante de aumentos em [S], sendo este ponto chamado de velocidade máxima (Vmáx).

Figura 1. Efeito da concentração de substrato na velocidade inicial de uma reação catalisada enzimaticamente.

Existem alguns casos em que a velocidade inicial não pode ser medida, ou porque não existe uma técnica experimental que permita acompanhar as variações das concentrações no sistema, ou a transformação não pode ser representada por uma equação química com reagentes e produtos definidos. A velocidade da reação, nesses casos, é freqüentemente representada por uma velocidade média de consumo, ou de produção, de substâncias convenientemente escolhidas (Figura 2) ou, ainda, pela variação de uma propriedade do sistema (viscosidade, textura, absorbância, etc.) em um intervalo de tempo prefixado.

Figura 2. Medida da velocidade média de formação do produto no intervalo de tempo ∆t.

O perfil cinético apresentado na Figura 1 levou Victor Henri a propor, em 1903, que uma enzima liga-se à molécula de seu substrato para formar o complexo ES, sendo este um passo obrigatório no processo catalítico enzimático. Esta idéia foi expandida em uma teoria geral da ação das enzimas, especialmente por Leonor Michaelis e Maud Menten, em 1913. Eles propuseram que a enzima primeiro combina-se reversivelmente com o substrato, para formar o complexo enzima-substrato, em um passo reversível relativamente rápido:

E + SES (1)

k1 k-1

A seguir, em um passo mais lento, o complexo ES se rompe com o reaparecimento da enzima livre e a formação do produto da reação P:

ESE + P (2)

A segunda reação (Equação 2) é mais lenta neste modelo e, portanto, limita a velocidade da transformação global do reagente em produto. Disto resulta que a velocidade da reação enzimática deve ser proporcional à concentração da substância reagente no segundo passo, ES.

Em qualquer instante de uma reação, a enzima existe em duas formas, a não ligada ao substrato, ou a forma livre E, e a forma ligada ES. Em concentrações pequenas do substrato [S], a maior quantidade da enzima estará na forma livre E. Nestas condições, a velocidade de reação será proporcional à [S] porque o equilíbrio da Equação 1, à medida que [S] aumentar, será deslocado na direção da formação de mais ES. A velocidade inicial máxima da reação

(Vmáx) será atingida quando praticamente todas as moléculas da enzima estiverem na forma do complexo ES, e a concentração da enzima livre E é insignificante. Neste caso, diz-se que a enzima está “saturada” com o substrato e a velocidade da reação não aumenta mais com os aumentos de [S]. Em solução contendo um excesso de substrato, haverá um período cinético inicial chamado de estado pré-estacionário, ocorrendo o crescimento da concentração de ES. O estado pré-estacionário é, usualmente, de duração muito curta. A reação atinge o estado estacionário muito rapidamente e a concentração do complexo [ES] permanecerá praticamente constante durante o decorrer do tempo.

1.1 Equação de Michaelis e Menten

A Figura 1 mostra a relação entre [S] e V0 para uma reação enzimática. A curva que expressa esta relação possui a mesma forma para a maioria das enzimas, sendo expressa pela

Equação de Michaelis e Menten, derivada por estes pesquisadores partindo de sua hipótese básica de que, nas reações enzimáticas, o passo limitante da velocidade é a quebra do complexo ES para formar o produto e a enzima livre.

A Equação de Michaelis-Menten (Equação 3) é a equação da velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e com um único substrato. É uma expressão da relação quantitativa entre a velocidade inicial V0, a velocidade inicial máxima Vmáx, e a concentração inicial de substrato [S], todas relacionadas através da constante de Michaelis-Menten, Km. A constante de Michaelis-Menten é uma constante dinâmica, ou de pseudoequilíbrio, que

concentrações no equilíbrio

expressa a relação entre as concentrações reais no estado estacionário ao invés de

Vmmáx+=0(3)

Uma relação numérica importante emerge da Equação de Michaelis-Menten no caso especial quando V0 é exatamente metade de Vmáx (Figura 1). Então:

[]SKm= → máxVV210=(4)

Km é equivalente à concentração de substrato na qual V0 é igual à metade de Vmáx, e indica a “afinidade” de uma enzima pelo seu substrato. Quanto menor for o valor de Km, maior será a afinidade da enzima pelo substrato.

Obs: Vmáx depende do k2, que é uma constante, e da concentração da enzima na experiência realizada. Vmáx é proporcional à concentração da enzima (Figura 3).

k1k2
E + SES E + P (5)

k-1

Figura 3. Gráfico de Vmáx variando de acordo com a [E].

1.1.1 Significado de Vmáx e Km

Todas as enzimas que exibem uma dependência hiperbólica de V0 em relação a [S] são ditas seguir a cinética de Michaelis-Menten Entretanto, esta equação não depende do mecanismo de reação relativamente simples de dois passos. Muitas enzimas possuem mecanismos de reação muito diferentes entre si; como enzimas que catalisam reações com seis ou oito passos identificáveis, que exibem o mesmo comportamento cinético no estado estacionário. Portanto, o significado real e a magnitude de Vmáx e Km podem variar de uma enzima para outra.

O significado real de Km depende de aspectos específicos do mecanismo de reação, como o número e as velocidades relativas dos passos individuas da reação. Considerando as reações de dois passos:

−+=(6)

kkKm

Para a reação de Michaelis-Menten, k2 é o limitante da velocidade; assim, quando k2

<< k-1, Km se reduz ao valor 11k k−. Onde esta condição prevalece o Km representa uma medida da afinidade da enzima pelo substrato no complexo ES. Muitas vezes k2 >> k-1, e então 12kkKm=. Em outros casos, k2 e k-1 são comparáveis e Km permanece com uma função mais complexa do relacionamento entre todas as três constantes de velocidade.

A Vmáx também varia muito de uma enzima para outra. Se uma enzima reage pelo mecanismo de dois passos de Michaelis-Menten, a Vmáx é equivalente a k2[Et], onde k2 é o passo limitante da velocidade. Entretanto, o número de passos da reação e a identidade do(s) passo(s) limitante(s) da velocidade podem variar de enzima para enzima.

Exemplo: Liberação do produto EPE + P é limitante da velocidade.
k1k2 k3
E + SES EP E + P (7)
k-1k-2

Na saturação, a maior parte da enzima está na forma EP e []EtkVmáx3=. Portanto pode-se definir a constante kcat para descrever a velocidade limitante de qualquer reação catalisada por uma enzima nas condições de saturação.

Cada enzima tem valores ótimos de kcat e Km que refletem o ambiente celular, a concentração do substrato normalmente encontrado in vivo pela enzima e a química da reação que está sendo catalisada.

1.1.2 Ordem da reação

1.1.2.1 Primeira ordem • Ocorre quando [S] << Km

SVV=0(8)

Considerando kKVm máx=:

[]SkV=0(9)

Onde: k: constante de velocidade de primeira ordem (min-1).

A Equação 9 indica que quando [S] é muito pequena, a velocidade absoluta diminui a cada momento, à medida que [S] decresce (Figura 4). Porém, em um certo momento, uma fração constante de substrato presente se transforma em produto:

Sdk1⋅−=(10)

Como V0 diminui com o tempo na região de primeira ordem, gráficos de [S] e [P] contra o tempo são curvos (Figura 5). Pode-se determinar a quantidade de substrato utilizada ou de produto formado durante qualquer intervalo de tempo utilizando a equação integrada de velocidade de primeira ordem, cujo resultado será:

S−=⋅(1)

Figura 5. Aparecimento de [P] e desaparecimento de [S] não são lineares com o tempo.

Um gráfico semilog da forma integrada da velocidade de primeira ordem possui uma inclinação 3,2k−, e uma interseção de log [S]0 no eixo de log [S] (Figura 6).

Figura 6. Gráfico semilog.

Obs: t1/2 é chamado de tempo de “meia vida”, que é o tempo necessário para converter em produto metade do substrato originalmente presente → relacionado ao k (Equação 12).

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