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PMI-2201 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Por: Prof. Antonio Carlos Vieira Coelho - EPUSP

O termo cromatografia é atribuído ao botânico russo Mikhael Semenovich Tswett que, no início do século empregou a técnica para a separação de pigmentos presentes em folhas de plantas, através da passagem de extratos de folhas, arrastados por éter de petróleo, através de leitos de carbonato de cálcio finamente dividido. As espécies separadas (clorofilas e xantofilas) apareciam nos leitos como bandas coloridas, e por isso Tswett chamou o método de cromatografia, do grego chroma (cor) e graphein (escrever).

A definição de cromatografia dada pela IUPAC em 1993 é a seguinte : “cromatografia é o método físico de separação no qual os componentes a serem separados se distribuem entre duas fases, uma das quais estacionária, enquanto a outra se movimenta numa direção definida”. A mistura que contém os componentes a serem separados é dissolvida na fase móvel. Durante a passagem da fase móvel através da fase estacionária, alguns componentes são fortemente retidos pela fase estacionária e por isso se movem lentamente com o fluxo da fase móvel; enquanto isso, outros componentes interagem fracamente com a fase estacionária, sendo transportados mais facilmente pela fase móvel. Devido a essas diferenças em mobilidade, os componentes da mistura podem ser separados e analisados de forma qualitativa e/ou quantitativa, pela própria técnica de cromatografia ou em conjunto com outras técnicas experimentais, tais como a espectrofotometria ou a espectrometria de massas.

Existem várias formas de realizar uma separação por meio de um processo cromatográfico. Diversas combinações são possíveis : a fase estacionária pode ser um sólido, um líquido imiscível à fase móvel ou um gel, fixado numa superfície plana ou dentro de uma coluna; a fase móvel pode ser um líquido, um gás, ou um fluído supercrítico (um vapor pressurizado, em temperatura acima de sua temperatura crítica, que possui a vantagem de ter menor viscosidade que o líquido, mas mantendo as propriedades de interação com os solutos). Detalhes sobre algumas dessas formas são disponíveis nas referências apresentadas ao final do texto, ficando este texto restrito apenas á apresentação de aspectos mais gerais da técnica.

Dentre os métodos modernos de análise química, a cromatografia é um dos mais empregados, encontrando aplicações nos mais variados ramos da pesquisa científica e tecnológica, devido à capacidade que possui de separar espécies químicas, de forma seletiva e específica.

Os métodos cromatográficos podem ser classificados de duas formas. A primeira, mais simples, é baseada na forma pela qual as duas fases são colocadas em contato. Segundo esse critério, os métodos poderiam ser classificados em duas categorias :

Ø cromatografia em coluna, na qual a fase estacionária é mantida dentro de um tubo, em geral bastante estreito, dentro do qual a fase móvel é forçada por efeito de pressão ou pela efeito da gravidade;

Ø cromatografia planar, na qual a fase estacionária é suportada numa superfície plana ou nos interstícios de um papel. A fase móvel se move através da fase estacionária por efeito da capilaridade ou da gravidade.

Outro critério de classificação, mais fundamental, é baseado nos tipos de fases estacionárias e móveis, e nos mecanismos envolvidos nas transferências de solutos entre as fases.

A fase estacionária pode ser sólida ou líquida. No caso de fase estacionária líquida, o líquido pode simplesmente estar espalhado sobre um suporte sólido ou então estar imobilizado sobre este. Neste último caso, a fase líquida pode ser chamada de “fase ligada”. A fase móvel pode ser líquida, gasosa ou um fluído supercrítico.

Os mecanismos que podem estar envolvidos em processos cromatográficos são mencionados na Figura 1, a seguir.

PMI-2201 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Por: Prof. Antonio Carlos Vieira Coelho - EPUSP

Adsorção : processo baseado em interações eletrostáticas, dipolares (Van de Waals, por exemplo) ou pontes de hidrogênio, que ocorrem entre grupos ativos presentes na superfície da fase estacionária sólida e a fase móvel. Em processos cromatográficos, a adsorção é sempre reversível (a dessorção do soluto implica na volta deste à fase móvel).

Partição : quando a fase estacionária é um líquido, espalhado na superfície de um suporte sólido e inerte ou nas paredes de um tubo, o processo é interfacial, ocorrendo por absorção, ou partição, que se baseia nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionária.

Troca Iônica : a fase estacionária é constituída de uma matriz onde são adicionados grupos funcionais ionizáveis (catiônicos ou aniônicos). A fase móvel é, geralmente, uma solução iônica com propriedades tamponantes, escolhidas de forma a ser compatível com o tipo de trocador usado.

Bioafinidade : utiliza grupos funcionais, ligados quimicamente à matriz estacionária, que possuam especificidade biológica. Esses grupos retiram da fase móvel somente as suas espécies complementares, deixando passar todas as outras espécies.

Exclusão : baseia-se em um processo puramente mecânico. A fase estacionária é uma matriz de composição inerte, com textura (superfície e distribuição de tamanhos de poros) controlada. Os componentes presentes na fase móvel podem ser separados porque os menores são capazes de penetrar facilmente em todos os poros da fase estacionária, equilibrando-se com a fase móvel que também entra nos poros, enquanto as maiores são excluídas, acompanhando a fase móvel que fica fora dos poros. As moléculas com tamanho intermediário entre esses dois extremos migram com velocidades variáveis, sendo que possuem penetração seletiva nos poros, entrando em alguns, mas não em todos.

Figura 1 – Representação esquemática dos mecanismos que podem estar envolvidos em processos cromatográficos

Processos cromatográficos que utilizam fases estacionárias líquidas quimicamente ligadas a um suporte sólido também podem apresentar um mecanismo de separação que é um compromisso entre adsorção (sobre sítios ativos do suporte sólido) e partição (que ocorre na fase líquida quimicamente ligada). A contribuição relativa de cada mecanismo depende da quantidade relativa de cada tipo de grupo funcional existente.

Uma classificação dos métodos cromatográficos, retirada de Collins et al. (1990), é apresentada na Tabela I

Tabela I - Classificação dos métodos cromatográficos, retirada de Collins et al. (1990)

TÉCNICA Fase Móvel

Fase Estacionária líquida sólido ligada líquida sólido ligada sólido ligada líquida Tipo de Cromatografia CP CCD CCD CGL CGS CGFL CSS CSFL CLL CLS CE CLFL CTI CB

Líquida PLANAREM COLUNA

Gasosa Fluido Supercrítico sólido ligada Líquida

Sigla emPortuguês Nome da TécnicaSigla emPortuguês

Nome da Técnica

CPcromatografia em papelCSFLcromatografia supercrítica com fase ligada CCDcromatografia em camada delgadaCLLcromatografia líquido-líquido CCDcromatografia em camada delgadaCLScromatografia líquido-sólido CGLcromatografia gás-líquidoCEcromatografia por exclusão CGScromatografia gás-sólidoCLFLcromatografia líquida com fase ligada CGFLcromatografia gás-fase ligadaCTIcromatografia por troca iônica CSScromatografia supercrítica com fase estacionária sólidaCBcromatografia por bioafinidade

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Não será possível tratarmos de todos os métodos cromatográficos ao longo deste texto. Assim sendo, trataremos apenas de métodos de cromatografia em colunas. Normalmente, esse método procede com um fluxo contínuo da fase móvel, que permanece até que todos os componentes da mistura em análise tenham saído da coluna e tenham sido detectados. A Figura 2 mostra esquematicamente como duas substâncias A e B podem ser separadas numa coluna por eluição. A eluição envolve o transporte das espécies através da coluna pela adição contínua de fase móvel fresca (também chamada de gás ou líquido de arraste). No instante inicial da análise ( t = t0 ), uma pequena quantidade da amostra, que pode inclusive estar diluída na fase móvel, é introduzida na coluna, em geral através de uma seringa manual ou de uma sistema de injeção automático, no menor intervalo de tempo possível. Conforme são transportados pela fase móvel, que entra de forma contínua na coluna, os componentes A e B da mistura vão se distribuindo ao longo das duas fases, e começa a se acentuar a separação entre os componentes ao longo das fases estacionária e móvel. Com o correr do tempo – que implica na adição de maiores quantidades de fase móvel fresca – o componente que interage mais fracamente com a fase estacionária vai sendo preferencialmente arrastado pela fase móvel. Isso ocorre porque a velocidade de arraste de um componente ao longo da coluna depende da fração de tempo que esse componente passa em cada fase : um componente que interage fracamente com a fase fixa, passa pouco tempo ligado à ela, permanecendo a maior parte do tempo na fase móvel. Idealmente, as diferenças entre velocidades de arraste leva à separação dos componentes da mistura em análise em bandas ou zonas da coluna. Com a continuação da passagem de fase móvel, as diferentes bandas vão se movendo ao longo da coluna, até atingir o seu final, onde são coletadas e/ou detectadas.

Se um detetor que responde à presença dos compostos da mistura é colocado no final da coluna e o seu sinal ao longo do tempo é registrado em função do tempo (ou em função de uma outra variável significativa, como por exemplo o volume de fase móvel adicionado), uma curva apresentando uma série de pico, chamada cromatograma, é obtida. Uma curva desse tipo é mostrada na parte inferior da Figura 2. A curva pode ser utilizada tanto para obtenção de dados qualitativos e quantitativos : a posição dos picos ao longo do eixo do tempo pode servir para identificação qualitativa dos compostos da amostra, enquanto que as áreas sob os picos fornecem informações a respeito das quantidades relativas de cada um dos componentes da mistura. A Figura 3 mostra os dados que podem ser obtidos a partir de um cromatograma e seus respectivos símbolos.

Figura 2 – (a) Representação esquemática mostrando a separação de uma mistura de componentes A e B através de uma coluna cromatográfica, por eluição. (b) Curva do sinal de saída do detetor (cromatograma).

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Coeficiente de Distribuição ( K )

A eficiência da separação que pode ser conseguida numa coluna cromatográfica depende das velocidades com a quais as diversas espécies atravessam a coluna (em outras palavras, a velocidade com que cada espécie é eluída). Essas velocidades são determinadas pelas magnitudes das constantes de equilíbrio das reações que regem as distribuições das diversas espécies entre a fase móvel e a fase estacionária.

Frequentemente, o tipo de equilíbrio envolvido em cromatografia pode ser descrito por equações simples, descrevendo o fenômeno de transferência de um soluto entre a fase móvel e a fase estacionária. Poderíamos escrever, para um composto A, a seguinte reação:

A fase móvelßà A fase estacionária

A constante de equilíbrio K para essa reação é chamada de coeficiente de distribuição ou coeficiente de partição, e pode ser definido como

K = ( CE / CM )(1)onde CE e CM representam as concentrações molares do composto A nas fase estacionária e móvel, respectivamente.

Idealmente, o coeficiente de distribuição K é constante ao longo de uma larga gama de concentrações, e processos cromatográficos baseados nessa hipótese são chamados de processos cromatográficos lineares. Toda a discussão que será feita ao longo deste texto será limitada a esses processos.

Tempo de Retenção ( tR ) e tempo de retenção corrigido ( t’R )

O tempo de retenção é o tempo gasto por um componente desde a sua injeção na coluna até a sua detecção na saída do sistema. O tempo de retenção engloba todo o tempo que um componente fica no sistema cromatográfico, seja diluído na fase móvel, seja retido na fase estacionária. A Figura 3 ilustra um cromatograma típico, com a presença de um três componentes. O tempo indicado em primeiro lugar no cromatograma indica o tempo gasto pelas moléculas da fase móvel para atravessar a coluna e atingir o detetor: esse tempo é chamado de tempo morto (“dead time”, tM ), e normalmente é determinado por algum composto ou impureza presente na mistura em análise que não é retido pela fase estacionária.

Quando tal composto não existe na mistura, é conveniente adicioná-lo, uma vez que é muito importante saber-se quanto tempo leva a fase móvel sem nenhum composto diluído para atravessar toda a coluna. No caso de cromatografia gasosa, esse tempo também pode ser determinado por alguma perturbação de pressão no sistema no momento da injeção, que aparece no cromatograma como uma perturbação na linha de base, de forma similar ao pico indicado na figura. Para a determinação dos tempos de retenção corrigidos (t’R) é necessário conhecer o tempo morto, uma vez que a correção é feita simplesmente descontando o seu valor do valor do tempo de retenção.

Relação entre Tempo de Retenção e Coeficiente de Distribuição

As velocidades lineares de um soluto ( v ) e das moléculas da fase móvel ( u ) podem ser dadas, respectivamente, por :

v = ( L / tR )(2)u = ( L / tM )(3) onde L é o comprimento da coluna cromatográfica.

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